Immunmodulatorische mesenchymale Stromazellen aus dem Amnion erhalten die Muskelfunktion in einem Mausmodell der Duchenne-Muskeldystrophie

Kernpunkte und Ergebnisse:

Dies ist eine Tierstudie. Es wurden keine Patienten behandelt. Ein japanisches Team der Universität Tokio, der Nippon Medical School und der Kaneka Corporation gab mdx-Mäusen, dem üblichen Mausmodell der Duchenne-Muskeldystrophie, menschliche mesenchymale Stromazellen aus dem Amnion (hAMSCs) durch wiederholte Injektion in die Schwanzvene und beobachtete die Mäuse bis zu einem Jahr.

Für eine Familie, die eine Behandlung erwägt, zeigt die Arbeit, dass diese Zellen im Labor das Immunsystem beruhigen, indem sie Makrophagen zum entzündungshemmenden M2-Typ verschieben, dass wiederholte intravenöse Dosen von Mäusen vertragen wurden und die Muskelentzündung verringerten und dass behandelte Mäuse nach einem Jahr mehr Griffkraft behielten, weiter liefen und eine etwas bessere Herzfunktion hatten. Sie zeigt nicht, dass dies bei Kindern geschieht. Die Zellen stammten aus dem Amnion, nicht aus der Nabelschnur wie die Zellen, die in unserem eigenen Programm verwendet werden, und sie stellten Dystrophin, das fehlende Protein, das die Krankheit verursacht, nicht wieder her. Die Zellen wurden von der Kaneka Corporation geliefert, die die Arbeit teilweise finanzierte und vier der Autoren beschäftigt.

Ziel:

Zu prüfen, ob hAMSCs menschliche Makrophagen zum M2-Typ polarisieren und ob wiederholte systemische hAMSC-Injektionen früh im Krankheitsverlauf die Funktion von Skelett- und Herzmuskel bei mdx-Mäusen verbessern.

Methoden:

Zellen. Das Amnion wurde mit Einwilligung aus den Eihäuten von Frauen mit Kaiserschnittentbindung entnommen. Die Zellen wurden durch enzymatischen Verdau isoliert, vermehrt, eingefroren und zwischen den Passagen 1 und 5 verwendet. Sie trugen die üblichen Marker mesenchymaler Stammzellen (CD73, CD90, CD105), es fehlten CD45, CD34, CD14, CD11b, CD19 und HLA-DR, und sie bildeten in Kultur Knochen und Knorpel, aber kein Fett.

Laborarbeit. Mononukleäre Zellen aus menschlichem Blut wurden im Verhältnis 20 zu 1 mit hAMSCs gemeinsam kultiviert, und Makrophagenmarker wurden durchflusszytometrisch und per qPCR gemessen, wobei Indometacin eingesetzt wurde, um Prostaglandin E2 (PGE2) zu blockieren.

Tiere. Männliche mdx-Mäuse auf einem C57BL/10-Hintergrund wurden zufällig in Kontroll- und Behandlungsgruppen aufgeteilt. Jede Dosis bestand aus 8,0 × 10⁵ hAMSCs in 100 µL Kochsalzlösung in die Schwanzvene, einmal pro Woche, beginnend im Alter von 4 bis 5 Wochen. Der Kurzzeitarm erhielt vier Dosen (n = 10, untersucht im Alter von 12 und 18 Wochen, gegenüber 14 mdx-Kontrollmäusen und 7 Wildtyp-Mäusen). Der Langzeitarm erhielt vier Dosen (n = 6) oder sechs Dosen (n = 4) und wurde nach einem Jahr untersucht, gegenüber 12 mdx-Kontrollmäusen und 7 Wildtyp-Mäusen. Viele Ergebnisse wurden an Teilgruppen von 3 bis 8 Mäusen gemessen, die unten angegeben sind. Der vorab festgelegte primäre Endpunkt war die motorische Langzeitfunktion (Griffkraft der Vorderpfoten und Laufgeschwindigkeit), die Histologie war sekundär. Die Untersucher konnten gegenüber dem Mausstamm nicht verblindet werden. Das Laufen wurde über fünf Tage von einem automatischen Laufrad aufgezeichnet. Daten wurden ausgeschlossen, wenn eine Maus Gewicht verloren hatte, verletzt oder geschwächt war oder wenn ein Wert als auffällig galt.

Ergebnisse:

Immunwirkungen in der Schale. hAMSCs senkten die Proliferation aktivierter T-Zellen von 90,1% auf 59,9% (p unter 0,0001) und sezernierten PGE2. Der Anteil CD206-positiver (M2) Zellen stieg moderat von 11,3% auf 14,2% (p = 0,035), während sich die M1-Zellen nicht veränderten. Indometacin hob den Anstieg von CD206 auf, was auf PGE2 als Vermittler hindeutet.

Verträglichkeit. Das Körpergewicht unterschied sich zwischen behandelten und unbehandelten mdx-Mäusen zu keinem Zeitpunkt. Andere Sicherheitsmaße (Organuntersuchung, Tumorscreening, Immunreaktion auf die menschlichen Zellen) werden nicht berichtet.

Kurzzeit (12 bis 18 Wochen Alter, vier Dosen):

• Die Kreatinkinase im Serum, der Marker für Muskelaustritt, war vier Wochen nach der letzten Dosis niedriger (435 ± 79 gegenüber 583 ± 92 ng/mL, p = 0,038, n = 6 gegenüber 4), aber nicht nach zehn Wochen (582 gegenüber 700 ng/mL, p = 0,228). Die Autoren nennen das vorübergehend.
• IL-6 im M. tibialis anterior: 10,0 ± 3,8 gegenüber 94,2 ± 64,1 pg/mL (p = 0,002, n = 4 gegenüber 5).
• Griffkraft nach 12 Wochen: 336,8 ± 21,0 g gegenüber 280,0 ± 37,8 g (p = 0,0008; auf das Körpergewicht bezogen 10,3 gegenüber 8,8 g/g, p = 0,012; n = 10 gegenüber 14).
• Fläche der Makrophagen (F4/80) im Zwerchfell: 14,0% gegenüber 19,5% (p = 0,013, n = 4 gegenüber 3). Der Anteil der Makrophagen mit dem M2-Marker CD206 im M. tibialis anterior stieg von 17,6% auf 55,5% (p unter 0,0001).
• Menschliche Zellen wurden vier Wochen nach der Behandlung im M. tibialis anterior gefunden, wo sie nur 0,0036% der Schnittfläche einnahmen, und waren nach zehn Wochen verschwunden. Dystrophin wurde nicht nachgewiesen, die Zellen reparierten den zugrunde liegenden Defekt also nicht.

Langzeit (ein Jahr, vier oder sechs Dosen, meist zusammengefasst):

• Infiltration mit mononukleären Zellen im M. tibialis anterior: 9,0% bei den Kontrollen, 7,3% nach vier Dosen, 4,7% nach sechs. Nur die Gruppe mit sechs Dosen erreichte Signifikanz (p = 0,038, n = 4 pro behandelter Gruppe gegenüber 14). Kein Unterschied im Zwerchfell.
• Fasern mit zentralen Zellkernen, ein Zeichen wiederholter Degeneration und Regeneration: 64,3% gegenüber 82,0% (p = 0,014, n = 5 gegenüber 7).
• Die Fibrose war im M. tibialis anterior, im Zwerchfell und im Herzen nicht verringert.
• Griffkraft: 296,5 ± 27,2 g gegenüber 265,7 ± 26,3 g (p = 0,049; auf das Körpergewicht bezogen 8,6 gegenüber 7,3 g/g, p = 0,002; n = 8 gegenüber 12). Wildtyp-Mäuse erreichten 336,4 g, behandelte Mäuse lagen also zwischen den beiden.
• Die maximale Laufgeschwindigkeit unterschied sich nicht (21,6 gegenüber 20,5 m/min, p = 0,77). Die tägliche Laufstrecke war größer (3.649 ± 1.025 gegenüber 2.420 ± 788 m/Tag, p = 0,028, n = 8 gegenüber 10), ebenso die durchschnittliche Strecke pro Minute (18,3 gegenüber 14,7 m/min, p = 0,047, n = 5 gegenüber 5).
• Herz: kein Unterschied in der groben Morphologie, in der Fibrose oder in der Makrophagenpolarisation, aber weniger mononukleäre Infiltration (n = 6 gegenüber 6) und eine höhere linksventrikuläre Verkürzungsfraktion, 37,0 ± 2,3% gegenüber 33,6% (p = 0,017; Wildtyp 39,6%). Die Kopfzeile von Tabelle 2 nennt 8 behandelte Mäuse, während die Fußnote und die Abbildungslegende 5 angeben, ein Widerspruch in der Arbeit selbst.

Schlussfolgerungen:

Die Autoren folgern, dass eine frühe, wiederholte systemische hAMSC-Behandlung Entzündung und motorischen Abbau bei mdx-Mäusen verzögerte, wahrscheinlich durch M2-Polarisation der Makrophagen und nicht dadurch, dass die Zellen zu Muskel wurden. Sie schlagen vor, sie könne mit Steroiden oder mit Gentherapie kombiniert werden.

Einschränkungen, die die Autoren nennen:

• Die Herzerkrankung bei mdx-Mäusen ist im Vergleich zu Patienten mild, die Herzbefunde geben daher nur begrenzte Auskunft über den Menschen. Sie schlagen vor, dies am Hundemodell zu bestätigen.
• Die menschlichen Zellen blieben nur kurz bestehen, und wie sezernierte Faktoren lang anhaltende Wirkungen hervorbringen, ist nicht geklärt. Der Mechanismus muss noch erarbeitet werden.
• Langzeitkultur und Vermehrung mesenchymaler Stammzellen bergen Risiken von Seneszenz und Chromosomenveränderungen, und die immunsuppressive Fähigkeit hängt von der Gewebequelle ab.
• Aus den Methoden: Die Untersucher waren gegenüber dem Stamm nicht verblindet, einige Daten wurden nach Ermessen ausgeschlossen, und die Langzeitgruppen waren klein.

Hintergrundinformationen:

Duchenne betrifft etwa 1 von 3.500 männlichen Neugeborenen. Steroide sind die übliche entzündungshemmende Behandlung, doch das Ansprechen ist unterschiedlich, und Nebenwirkungen sind häufig. Dasselbe Team berichtete zuvor, dass wiederholte intravenöse Stammzellen aus der Zahnpulpa die Bewegungsaktivität bei mdx-Mäusen und dystrophen Hunden aufrechterhielten. Die Autoren halten fest, dass intravenös gegebene mesenchymale Stammzellen größtenteils in der Lunge hängen bleiben und dort sterben und dass ihre Immunwirkung offenbar daher kommt, wie die eigenen Fresszellen des Empfängers auf die absterbenden Zellen reagieren. Die Arbeit enthält keine Daten zu Zellen aus der Nabelschnur und erwähnt keine Studie am Menschen mit Zellen aus dem Amnion bei Duchenne.