In-vivo-Therapie beim vorgeburtlichen Verschluss der Myelomeningozele im Schaffetenmodell mit mesenchymalen Stammzellen aus menschlicher Nabelschnur: Machbarkeitsnachweis, Studienzusammenfassung

Kernpunkte und Ergebnisse:

Dies ist eine Tierstudie an ungeborenen Lämmern. Menschen wurden nicht behandelt. Ein Team des Universitätsklinikums Hamburg-Eppendorf erzeugte an der Wirbelsäule von Lammfeten einen Spina-bifida-Defekt (Myelomeningozele) und verschloss ihn anschließend im Mutterleib, wie es Chirurgen bei der fetalen Operation am Menschen tun. Bei einigen Lämmern brachten sie zuvor mesenchymale Stammzellen (MSCs) aus menschlicher Nabelschnur direkt auf das freiliegende Rückenmark auf. Die Zellen stammten aus Desacell, einem gebrauchsfertigen Produkt aus dem Nabelschnurgewebe eines einzelnen gesunden Neugeborenen. Frühere Schafstudien hatten Zellen auf einem Pflaster verwendet, dies war also der erste Bericht über das Aufbringen einer flüssigen Zellsuspension auf diese Weise.

Die Studie zeigte, dass sich die Zellen bei allen fünf dafür vorgesehenen Lämmern aufbringen ließen. Ob die Zellen halfen, konnte sie nicht zeigen. Nur drei der sieben operierten Lämmer wurden lebend geboren (zwei behandelt, eines unbehandelt), alle drei hatten normale oder nahezu normale Bewegungswerte, und das unbehandelte Lamm hatte sogar die höchste Dichte überlebender großer Nervenzellen. Die Autoren sagen selbst, dass die Stichprobe für einen Vergleich zwischen den Gruppen zu klein war.

Ziel:

Hauptziel war zu prüfen, ob sich ein gebrauchsfertiges Produkt aus MSCs menschlicher Nabelschnur (Desacell) bei der fetalen Operation der Spina bifida beim Schaf lokal auf das Rückenmark aufbringen lässt. Nebenziele waren zu sehen, ob die Zellen die Bewegung auf der Sheep Locomotor Rating Scale (SLR) verbesserten, ob sie die Größe des Rückenmarks und seiner grauen Substanz erhöhten und ob die Dichte großer Nervenzellen mit der Bewegung zusammenhing.

Methoden:

Verwendet wurden trächtige Mutterschafe eines einzigen Züchters, deren Lämmer alle vom selben Bock stammten. Die Studie wurde von der Hamburger Landesbehörde nach dem deutschen Tierschutzgesetz genehmigt.

Etwa am 75. Trächtigkeitstag (eine Schafträchtigkeit dauert etwa 145 Tage) öffneten die Chirurgen die Gebärmutter, entfernten Haut, Rückenmuskeln und die Wirbelbögen von L1 bis L5 und öffneten die Rückenmarkshaut (Dura), die das Rückenmark bedeckt. Dadurch liegt das Rückenmark im Fruchtwasser frei, ähnlich wie bei Spina bifida. Etwa 25 Tage später wurde der Defekt in einer zweiten Operation verschlossen. Die Lämmer wurden im Verhältnis zwei zu eins einem Verschluss mit oder ohne Zellen zugeteilt. In der Zellgruppe wurde Narbengewebe über dem Rückenmark entfernt und 1 mL Desacell-Gelsuspension mit 30 Millionen Zellen direkt auf das Rückenmark gegeben. Alle Lämmer erhielten danach ein mehrschichtiges Pflaster und einen Hautverschluss. Bei Zwillingsträchtigkeiten wurde ein Zwilling behandelt, der andere diente als Kontrolle oder wurde nicht operiert.

Die Zellen stammten aus einer einzigen Spendernabelschnur, erfüllten die internationalen Identitätskriterien für MSCs und wurden auf Sterilität, Mykoplasmen und Endotoxin getestet. Sie wurden aufgetaut, gewaschen, gezählt und gekühlt (4 °C) zum Operationsort gebracht.

Die Lämmer wurden zum Termin geboren und 2 und 48 Stunden nach der Geburt gefilmt. Gutachter, die nicht wussten, welche Lämmer Zellen erhalten hatten, bewerteten die Bewegung auf der 15-Punkte-SLR-Skala, auf der 15 normales Gehen und 0 bis 4 eine schwere Beeinträchtigung bedeutet. Danach wurden die Lämmer eingeschläfert, und das lumbale Rückenmark wurde in fünf bis acht Segmente geschnitten, gefärbt und vermessen. Ein ebenfalls verblindeter Neuropathologe zählte große motorische Nervenzellen pro Quadratmillimeter grauer Substanz. Vor der Studie hatten die Autoren berechnet, dass Gruppen von drei und sechs Lämmern nur eine Teststärke von 25,5 % ergeben würden, ein echter Unterschied also höchstwahrscheinlich übersehen würde.

Ergebnisse:

Überleben: Bei 11 Lammfeten wurden Defekte erzeugt, im Mittel am 76,9. Tag.

• Drei gingen nach der ersten Operation verloren. Ein Mutterschaf entwickelte eine Wunddehiszenz mit Darmverschluss und wurde eingeschläfert, ein Fetus starb, nachdem das Mutterschaf Fieber hatte, und einer starb am Tag einer Wundkomplikation.
• Bei einem weiteren Lamm war der Fetus chirurgisch nicht erreichbar, sodass sieben Lämmer operiert wurden, im Mittel am 104,3. Tag. Fünf erhielten Zellen, zwei nicht.
• Vier weitere Feten starben 11 bis 17 Tage nach dem Verschluss: drei der fünf behandelten Lämmer und eines der zwei unbehandelten. Eines hatte einen Pilzabszess an der Wirbelsäule mit ausgedehnter Pilzinfektion. Die Ursache der übrigen Todesfälle war unklar.
• Drei Lämmer wurden nach 144 bis 147 Tagen lebend geboren: Lamm 1 (ohne Zellen) und die Lämmer 3 und 4 (mit Zellen). Die Veröffentlichung gibt die Lebendgeburtenrate insgesamt mit 30 % an.

Bewegung (SLR-Skala, von 15):

• Lamm 1 (ohne Zellen) erreichte nach 2 Stunden 15 und nach 48 Stunden 15 Punkte.
• Lamm 3 (mit Zellen) erreichte nach 2 Stunden 13 und nach 48 Stunden 15 Punkte.
• Lamm 4 (mit Zellen) erreichte nach 2 Stunden 15 und nach 48 Stunden 15 Punkte.

Alle drei Lämmer gingen also nach 48 Stunden normal, ob sie Zellen erhalten hatten oder nicht, sodass die Werte keinen Nutzen zeigen konnten.

Rückenmarksgewebe: Bei keinem Lamm wurde ein Tumor gesehen, weder mit bloßem Auge noch unter dem Mikroskop.

• Die mittlere Dichte großer Nervenzellen betrug beim unbehandelten Lamm 20,4 pro mm², gegenüber 15 und 13,1 pro mm² bei den beiden behandelten Lämmern. Die Autoren weisen darauf hin, dass dies dem Gegenteil früherer Befunde entspricht.
• Die mittlere Fläche der grauen Substanz war bei den behandelten Lämmern größer (274 und 218 Einheiten gegenüber 171 beim unbehandelten Lamm), und der Anteil der grauen Substanz am Rückenmark betrug 0,32 und 0,48 gegenüber 0,31. Die Autoren vermuten, dies „könnte möglicherweise auf einen besseren Gewebeerhalt hindeuten“.
• Die Flächen wurden in Bildpixeln gemessen, und statistische Tests zum Vergleich der Lämmer wurden nicht berichtet.

Schlussfolgerungen:

Die Autoren folgern, dass das Aufbringen eines Produkts aus MSCs menschlicher Nabelschnur bei der fetalen Operation der Spina bifida beim Schaf machbar ist und dass größere Studien mit Desacell nötig sind, um Bewegung, Nervenschutz und Sicherheit zu prüfen.

Die Studie ist ein erster technischer Schritt. Nur ein unbehandeltes und zwei behandelte Lämmer konnten beurteilt werden, sodass die Ergebnisse nicht zeigen können, ob die Zellen wirken. Die Autoren nennen drei Hauptgrenzen: die hohe fetale Sterblichkeit, die jeden sinnvollen Vergleich unmöglich machte und auf chirurgische Probleme ohne Bezug zu den Zellen zurückgehen könnte; keine Spezialfärbung (Immunhistochemie), sodass sie nicht bestätigen konnten, dass die Zellen im operierten Bereich noch vorhanden waren; und zu wenige Überlebende, als dass die Bewegungswerte aussagekräftig wären. Hinzu kommt, dass das unbehandelte Lamm normal ging. Das deutet darauf hin, dass der Defekt in diesem Modell bei diesen Tieren keine bleibende Schwäche verursachte, und mit einem Lamm pro Vergleich können die Unterschiede bei grauer Substanz und Nervenzellen leicht Zufall sein. Langzeitergebnisse wie Blasenfunktion oder Tethered-Cord-Syndrom wurden nicht untersucht, weil die Lämmer nur bis 48 Stunden nach der Geburt untersucht wurden.

Hintergrundinformationen:

Spina bifida betrifft in Europa etwa 1 von 2.000 Schwangerschaften. Die MOMS-Studie zeigte, dass ein Verschluss vor der Geburt den Bedarf an einem Shunt zur Ableitung von Hirnflüssigkeit halbiert und die Chance, mit 30 Monaten zu gehen, verdoppelt. Dennoch können 58 % der vor der Geburt operierten Kinder nicht selbstständig gehen. Forscher hoffen, dass zusätzliche Stammzellen beim Verschluss das freiliegende Rückenmark weiter schützen könnten.

Das Zellprodukt Desacell wird als gebrauchsfertiges Produkt beschrieben, das mit einem patentierten Isolationsprotokoll hergestellt wird. Hersteller und Patentinhaber nennt die Veröffentlichung nicht. Die Autoren geben an, dass es an Nagetieren und frühgeborenen Pavianen, bei Erwachsenen mit schwerem Lungenversagen (CIRCA-19) und bei Frühgeborenen mit Risiko für eine chronische Lungenerkrankung (HULC-1) getestet wurde und bei Erwachsenen mit septischem Schock (UC-CISS II) untersucht wird. Die zitierte Pavianstudie unter Leitung des Mitautors Möbius trägt den Titel „Prophylactic administration of mesenchymal stromal cells does not prevent arrested lung development in extremely premature-born non-human primates“. Zwei der Autoren gehören zum Sächsischen Zentrum für feto/neonatale Gesundheit der Technischen Universität Dresden.

Die Studie wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG BA 7308/4-1) finanziert. Die Autoren geben an, keine Interessenkonflikte zu haben. Die Arbeit ist ausschließlich ein Tierversuch, und die Autoren verweisen auf die laufende CuRe-Studie mit Plazentazellen auf einem Pflaster als erste Studie am Menschen, in der Stammzellen beim fetalen Verschluss der Spina bifida gegeben werden.